一键生成配液表

摩尔与 pmol 校准

支持粘末端与平末端

DNA 连接反应摩尔比计算器

计算质粒分子克隆所需的插入片段 DNA 质量，支持 3:1、5:1 常见摩尔比换算与 pmol 摩尔数校验，并自动生成标准 T4 DNA 连接酶配液体系表。

连接实验参数输入

粘性末端 (Cohesive)

载体长度 (bp)

线性化质粒骨架大小 (bp)

插入片段长度 (bp)

目标基因或插入 DNA 片段大小 (bp)

载体用量 (ng)

常规 10–20 µL 体系推荐用量：25 – 100 ng

摩尔比 (插入片段 : 载体) (Insert : Vector)

计算结果看板

所需插入片段质量

需加入的插入片段质量 (3:1)

37.5 ng

≈ 0.0375 µg

载体摩尔量0.019 pmol

插入片段摩尔量0.057 pmol

推荐连接温育条件16°C 过夜（连接效率最高）或室温 (20–25°C) 快速温育 15–30 分钟。

T4 DNA 连接酶反应配液体系 (20 µL)

根据 DNA 浓度与所需体积自动换算的实验台配液指导表。

反应总体积:

载体母液浓度 (ng/µL)

插入片段母液浓度 (ng/µL)

反应组分	目标加入量	取样体积 (µL)
10X T4 DNA Ligase Buffer	1X final	2.0 µL
Vector DNA (4000 bp)	50 ng	2.00 µL
Insert DNA (1000 bp)	37.5 ng (3:1)	1.88 µL
T4 DNA Ligase (400 U/µL)	400 U	1.0 µL
Nuclease-free H₂O	补足至反应体积	13.13 µL
反应体系总量	—	20.0 µL

科学计算原理与公式

质粒重组连接的核心在于维持插入片段与载体游离末端的摩尔比平衡：

Insert Mass_ng=Vector Mass_ng×Insert Length_bpVector Length_bp×Molar Ratio_{Insert : Vector}

双链 DNA 平均分子量按 660 g/(mol·bp) 折算。通过控制 picomoles (pmol) 摩尔比，可极大增加 T4 连接酶催化双分子碰撞并形成环状分子的概率。

Standard

3:1 Molar Ratio

粘性末端限制性酶切克隆（如 EcoRI, BamHI）的黄金标准比例。在保证插入片段充分碰撞的同时，显著压制空载体自连背景。

Difficult & Blunt

5:1 Molar Ratio

平末端克隆（如 EcoRV, SmaI）或短片段插入推荐使用。由于平末端缺少碱基氢键互补退火，需要更高摩尔浓度增加空间碰撞碰撞率。

Large Inserts

1:1 Molar Ratio

超大片段（> 5 kb）或双质粒片段等摩尔置换时使用，防止过高摩尔浓度导致多片段串联体 (concatemers) 产生。

克隆实验排错清单 (Troubleshooting)

1. 转化后平板无菌落或菌落极少？

检查 10X T4 Buffer 中的 ATP 是否反复冻融失效；通过凝胶电泳确认 DNA 是否降解；如采用电转化，转化前务必进行 65°C 10 分钟热灭活或脱盐，防止电击打火死菌。

2. 平板上长出海量空载体背景（假阳性高）？

单酶切或双酶切不完全所致。单酶切载体必须用碱性磷酸酶（CIP / rSAP）彻底去磷酸化 5' 末端以防自连。

3. 菌落生长良好，但菌落 PCR / 测序未检出插入片段？

尝试将摩尔比从 3:1 提高到 5:1；确保胶回收切胶纯净，去除引物二聚体及非特异性扩增短条带竞争。

常见问题解答 (FAQ)

为什么粘末端连接推荐 3:1 摩尔比？

3:1 的插入片段过量比例使载体末端优先与插入片段末端退火结合，而非与载体自身的另一端碰撞自闭环，从而将重组克隆率提升至最高。

一个连接反应通常应该用多少载体 DNA？

常规标准推荐 20 µL 反应体系中加入 25 ng 至 100 ng 线性化载体。载体量过多（> 200 ng）反而会导致连接副产物串联并抑制转化效率。

连接产物可以直接加入感受态细胞转化吗？

化学感受态细胞（热激转化）可直接加入 2–5 µL 连接液；如果是电转化感受态，连接体系中的盐离子会导致电击杯打火爆杯，必须先进行柱纯化脱盐或 1:5 稀释后取 1 µL 进行电击。

应该选择 10 µL 还是 20 µL 体系？

10 µL 微量反应体系更节省贵重的 T4 DNA 连接酶和 10X Buffer；当胶回收后 DNA 浓度偏低时，推荐使用 20 µL 体系以容纳更多体积的模板。