蛋白浓度计算器 (BCA、Bradford 标准曲线与 UV A280)
通过相邻 BCA 或 Bradford 实测标准点插值估算蛋白浓度，并单独查看线性拟合诊断；也可使用 A280 比尔-朗伯定律直接测定。
标准曲线分析
| # | Std Conc (µg/mL) | 吸光度 (OD) | Action |
|---|---|---|---|
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Unknown 蛋白质 样品 Reading
标准曲线结果
样品浓度通过相邻实测标准点之间的分段线性插值计算。R² 来自单独的线性拟合，用于评估曲线线性度。
蛋白浓度计算器方法学原理：BCA比色法 vs Bradford法 vs A280紫外吸收
准确测定蛋白质浓度是分子生物学、抗体表征、酶动力学分析和 Western Blot 等实验的基石。实验室中最主流的三种定量方法原理如下：
BCA 法 (562 nm)
在碱性条件下，肽键及半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸残基将 Cu²⁺ 还原为 Cu⁺，随后与 BCA 络合生成深紫色化合物。耐受高达 5% 的 SDS、Triton X-100 等去垢剂。
Bradford 法 (595 nm)
考马斯亮蓝 G-250 染料与碱性（主要是精氨酸）及芳香族残基结合，最大吸收波长从 465 nm 移至 595 nm。对还原剂（DTT、β-ME）兼容性极好，但对去垢剂敏感。
直接紫外 A280
利用色氨酸和酪氨酸在 280 nm 处的固有紫外吸收直接定量（朗伯-比尔定律）。快速无损，无需孵育试剂，但易受核酸 (A260) 交叉吸收干扰。
常用蛋白定量方法化学试剂兼容性表（去垢剂与还原剂耐受度）
| 常见干扰试剂 | BCA 法 | Bradford 法 | 直接紫外 A280 |
|---|---|---|---|
| 去垢剂 (SDS, Triton X-100, NP-40) | 兼容 (最高 5%) | 不兼容 (> 0.1% 沉淀) | 兼容 |
| 还原剂 (DTT, β-ME, TCEP) | 不兼容 (还原 Cu²⁺) | 兼容 (最高 5 mM DTT) | 兼容 (需扣除空白) |
| 核酸 (DNA / RNA) | 无明显干扰 | 轻微干扰 | 严重干扰 (需260/280校正) |
蛋白浓度计算器实验范例：细胞裂解液 BCA 标曲定量
实例场景：细胞裂解液 BCA 浓度测定与 Western Blot 上样量换算
某 RIPA 细胞裂解液按 1:5 稀释（DF = 5）。562 nm 测得稀释液 A₅₆₂ = 0.485；相邻 BSA 标准点为 500 µg/mL（A = 0.412）和 750 µg/mL（A = 0.578）。
- 1. 实测吸光度位于两个标准点之间: 0.412 < 0.485 < 0.578
- 2. 稀释样浓度（相邻点线性插值）: 500 + ((0.485 − 0.412) / (0.578 − 0.412)) × 250 = 609.9 µg/mL
- 3. 原液浓度: 609.9 µg/mL × 5 (DF) = 3049.7 µg/mL ≈ 3.05 mg/mL
- 4. WB 上样量: 每泳道上样 30 µg 蛋白时，取样体积为 30 / 3.05 ≈ 9.84 µL。
常见问题解答 (FAQ)
什么时候应该选择 BCA 法而不是 Bradford 法？
如果裂解液中含有高浓度表面活性剂（如 SDS、Triton X-100、NP-40，常见于膜蛋白和 RIPA 裂解液），应首选 BCA 法；若体系中含有 DTT 或 β-巯基乙醇等还原剂，则应首选 Bradford 法。
如何解读蛋白标准曲线的 R²？
R² 描述线性拟合程度，只能作为诊断指标，不能单独证明曲线或检测范围适用。还应检查试剂盒说明、残差、重复间差异和信号范围。本计算器通过相邻实测标准点插值估算样品浓度，与页面显示的线性拟合分开计算。
核酸污染是如何严重干扰紫外 A280 测定结果的？
核酸在 260 nm 处的吸光系数约为蛋白在 280 nm 处的 30–50 倍。样品中仅需 5% 的 DNA 污染就会导致测得的 A280 读数翻倍，造成极大虚高。
为什么在紫外蛋白定量中必须扣除 A320 背景吸光度？
纯蛋白质在 320 nm 无吸收。A320 的正信号完全来自不可溶蛋白聚集体沉淀或灰尘引起的光散射。扣除 A320 可以有效消除样品浑浊度带来的系统假阳性偏差。
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