蛋白质电泳

Laemmli不连续缓冲体系

分离胶（pH 8.8）与浓缩胶（pH 6.8）

SDS-PAGE配胶计算器 (分离胶与浓缩胶配比表)

一键生成标准 Laemmli 不连续 SDS-PAGE 蛋白电泳凝胶配方。根据目标蛋白分子量推荐最佳分离胶浓度（6% 至 18%），自动计算丙烯酰胺、Tris 缓冲液、SDS、APS 及催化剂 TEMED 的精确加入量。

凝胶尺寸与目标蛋白大小

选择 cassette thickness, resolving percentage, and 储液 reagent 浓度.

胶板间隔厚度

制胶数量

分离胶浓度（%）

Separation 目标: Housekeeping 蛋白质 (GAPDH, Actin, Tubulin) (12–70 kDa)

Acrylamide 储液 Solution

移液余量（%）

Laemmli 凝胶配制方案

For 2 gel(s) (1.0 mm) with 10% excess 体积

1. Resolving Gel (12%, 总计: 11.0 mL)

pH 8.8

Milli-Q 去离子水：3.62 mL

30% Acrylamide/Bis:4.40 mL

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8:2.75 mL

10% SDS:110.0 µL

10% APS（现配）：110.0 µL

TEMED (添加 last!):11.0 µL

2. Stacking Gel (4.0%, 总计: 4.4 mL)

pH 6.8

Milli-Q 去离子水：2.62 mL

30% Acrylamide/Bis:0.59 mL

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8:1.10 mL

10% SDS:44.0 µL

10% APS（现配）：44.0 µL

TEMED (添加 last!):6.6 µL

添加 APS and TEMED immediately before pouring. Overlay resolving gel with 200–500 µL isopropanol or water to block air and ensure a flat interface. Polymerization takes ~20–30 min.

SDS-PAGE配胶计算器化学原理：丙烯酰胺交联与催化聚合机理

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 严格基于蛋白质的分子量进行分离。SDS 是一种阴离子去垢剂，能以恒定比例（约 1.4 g SDS / 1 g 蛋白质，或约每 2 个氨基酸结合 1 个 SDS 分子）与变性蛋白质结合，掩盖其自身电荷，赋予其均匀的负电荷密度和刚性棒状构象。

自由基聚合反应

过硫酸铵 (APS) 自发分解产生硫酸自由基，TEMED 催化加速此过程。自由基引发丙烯酰胺单体与甲叉双丙烯酰胺交联形成网状凝胶孔隙。

凝胶孔径与分子筛效应

丙烯酰胺浓度越高，平均凝胶孔径越小。小分子蛋白质（< 30 kDa）需要 15–18% 凝胶防止跑脱出胶底，而大分子复合物（> 150 kDa）则需 6–8% 大孔径凝胶。

分离胶浓度与蛋白质分子量最佳分离范围对照表

凝胶浓度 (%)	最佳分离范围 (kDa)	典型参考标志物	推荐实验应用
6% – 7.5%	50 – 250+ kDa	肌球蛋白 (200 kDa), β-半乳糖苷酶 (116 kDa)	超大分子量抗原、膜蛋白复合体
8% – 10%	25 – 150 kDa	磷酸化酶 b (97 kDa), BSA (66 kDa), 卵白蛋白 (45 kDa)	通用标准蛋白分析、抗体重链/轻链粗检
12% (最常用)	15 – 80 kDa	BSA (66 kDa), 碳酸酐酶 (29 kDa), 胰蛋白酶抑制剂 (20 kDa)	常规全细胞裂解液、中等分子量重组表达
15%	10 – 50 kDa	溶菌酶 (14.4 kDa), 抑肽酶 (6.5 kDa)	小分子多肽、趋化因子、切割标签分子
18%	4 – 30 kDa	胰岛素 (5.8 kDa), 极小短肽 (Tris-Tricine 更佳)	短肽与小分子水解产物分析

模拟跑胶迁移图：不同分离胶浓度对蛋白质条带分辨率的影响

Laemmli法凝胶模拟

高浓度凝胶（如 15%）使大分子量蛋白压缩在凝胶上层，但能拉开小分子间距；低浓度凝胶（如 8%）使小分子迅速随染料前沿跑出，但能精细分辨 100+ kDa 蛋白。

经典 Laemmli 不连续缓冲液系统的等速电泳聚焦原理

Laemmli 不连续缓冲体系的超高条带清晰度主要归功于浓缩胶中的等速电泳 (Isotachophoresis) 浓缩机制：

1. 浓缩相 (pH 6.8 浓缩胶)

氯离子 (Cl⁻) 迁移率极高作为先导离子。甘氨酸在 pH 6.8 下几乎全以两性离子存在，净电荷接近于 0 作为后随离子。蛋白质-SDS 复合物迁移率居中，被两层离子在分离胶交界面压缩为极窄的极薄薄层（< 0.1 mm）。

2. 分离相 (pH 8.8 分离胶)

进入 pH 8.8 分离胶后，甘氨酸充分解离带有负电荷，迁移率骤增并超越蛋白质堆叠层。蛋白质随后单纯依靠聚丙烯酰胺凝胶网孔的分子筛效应，按分子量大小有序分离。

SDS-PAGE配胶计算器实操示例：灌制两块 1.0 mm 12% 实验胶

实例场景：灌制两块 1.0 mm 12% 迷你胶 (+10% 备用余量)

实验目标：检测 Actin (42 kDa) 和 GAPDH (36 kDa)。分离胶总体积 = 11.0 mL；浓缩胶总体积 = 4.4 mL。

分离胶 (12%): 3.63 mL H₂O + 4.40 mL 30% Acr/Bis + 2.75 mL 1.5 M Tris (pH 8.8) + 110 µL 10% SDS + 110 µL 10% APS + 11 µL TEMED.
浓缩胶 (4%): 2.68 mL H₂O + 0.59 mL 30% Acr/Bis + 1.10 mL 0.5 M Tris (pH 6.8) + 44 µL 10% SDS + 44 µL 10% APS + 6.6 µL TEMED.

常见问题解答 (FAQ)

如何根据目标蛋白的分子量选择最合适的分离胶浓度？

推荐选型：6% 适合 50–250 kDa 大蛋白；8% 适合 30–180 kDa；10% 适合 20–100 kDa；12% 适合 12–70 kDa（最适合肌动蛋白、GAPDH 等内参）；15% 适合 8–45 kDa；18% 适合 4–30 kDa 小肽与泛素。

为什么分离胶灌注后必须用异丙醇或去离子水压顶封层？

空气中的氧气会淬灭自由基并阻碍丙烯酰胺聚合。灌胶后立即用异丙醇或水压顶封层，既能有效隔绝空气，又能使分离胶上表面形成极其平整的水平界面。

为什么过硫酸铵（APS）溶液建议现用现配？

过硫酸铵水溶液在室温下极易自发水解失活。过期的 APS 无法提供足量硫酸根自由基，会导致凝胶聚合迟缓、凝胶质地偏软甚至无法固化。可配制 10% 溶液分装冻存于 -20°C。

TEMED 在凝胶配制中起到什么化学催化作用？

TEMED 是一种叔胺催化剂，可极大加速过硫酸盐均裂生成硫酸根自由基的过程。由于加入 TEMED 后数分钟内即开始聚合，因此必须在所有液体混匀后的最后一步加入并立即灌胶。