核酸濃度計算機｜A260・純度比
A260、吸光度の換算光路長、希釈倍率から核酸濃度を推定し、A260/A280・A260/A230比を計算します。参考スペクトルの模式図で混入物の影響を説明します。
核酸濃度・吸光度比計算
NanoDropの核酸測定表示値が10 mm換算済みなら、実際の測定光路が短くても10 mmを選んでください。短光路は、その光路長で報告された未換算値にのみ使います。3つの吸光度は同じ換算基準で入力してください。
ブランク補正済みの吸光度を入力してください。A280とA230は省略できます。比率の計算にはA260と分母の両方が正である必要があります。
希釈前の推定濃度
42.5 ng/µL
0.043 µg/µL = 0.043 mg/mL
推定総収量
2.13 µg
希釈前の試料全量を使います。体積は正の値が必要です。
A260 / A280
1.85
代表値約1.8、比較範囲1.7〜2。
A260 / A230
2.07
一般的な参考範囲：約2.0〜2.2。
濃度 = A260 ×（10 / 光路長mm）× 50 × 希釈倍率。総量（µg）= 濃度（ng/µL）× 希釈前の全量（µL）/ 1000。
比較範囲はスクリーニングの目安です。混入物、pH、ブランク不一致、測定ノイズで値は変化し、範囲内でも純度や完全性は保証されません。特に低吸光度では装置の測定範囲を確認してください。
吸光度と濃度の関係
核酸の濃度測定はランベルト・ベールの法則に基づきます：
Aは260 nmの吸光度、bは光路長（cm）、εは吸光係数です。cの単位はεと対応させ、モル吸光係数ならmol/Lを使います。以下は10 mm（1 cm）換算での質量濃度の経験的な概算係数です：
- 二本鎖 DNA (dsDNA): 1.0 A260 = 50 µg/mL (50 ng/µL)
- 一本鎖 RNA (ssRNA): 1.0 A260 = 40 µg/mL (40 ng/µL)
- 一本鎖 DNA（一般的な概算）: 1.0 A260 ≈ 33 µg/mL (33 ng/µL)
50と40も一般的な経験係数です。短いオリゴ、修飾核酸、特定配列の正確な定量には固有の吸光係数を使います。A260には他の吸光物質も寄与するため、結果は紫外吸光法による推定値です。
A260/A280・A260/A230比の見方
以下は近似的な参考値で、混入物の同定基準ではありません。計算機はdsDNAのA260/A280を1.7〜2.0、RNAを1.9〜2.2、A260/A230を2.0〜2.2と比較します。範囲内でも純度や完全性を保証しません。
| 試料 | A260/A280 | A260/A230 | 解釈上の注意 |
|---|---|---|---|
| dsDNA | ≈ 1.8 | ≈ 2.0–2.2 | 緩衝液、pH、濃度に依存 |
| RNA | ≈ 2.0 | ≈ 2.0–2.2 | 比率からRNAの完全性は分かりません |
| ssDNA・オリゴ | 配列や測定条件に依存 | 一律の合否判定は行いません。定量には配列固有の吸光係数を推奨 | |
紫外吸収スペクトルの模式図：DNAと混入物
実測データではなく教育用の模式図です。DNA基準曲線のA260を1とし、同じDNA背景に吸光物質の寄与を加えています。混入物はA260にも影響しうるため、3本を別々に正規化していません。
グアニジン残留で230 nm付近の吸収は高くなりえますが、特異的な特徴ではありません。フェノールは260〜280 nm領域にも影響します。原因の判断には実測スキャン、ブランク、他の測定結果を併せて確認してください。
図と異常な比率の読み方
上図の曲線はDNA吸収と混入物による影響の模式例で、計算機の入力値から描いたものではありません。実測スペクトルの代用にはならず、A230、A260、A280の3つの値から全スペクトルやピーク位置を求めることもできません。
低いA260/A280はタンパク質、フェノール、pH、ブランク不一致などで生じます。低いA260/A230は抽出試薬の残留やブランク不一致でも生じます。高すぎる比率も、特に分母がゼロに近い場合は再測定してください。まずブランク、測定範囲、再現性を確認し、抽出キットの手順に沿って調べます。
参考資料：Thermo Scientific NanoDrop Nucleic Acid Technical Guide · NanoDrop 2000 FAQ
計算例
計算実例：ミニプレッププラスミドDNA収量と純度検定
未希釈のプラスミド溶液（希釈倍率1）をNanoDrop核酸モードで測定。10 mm換算表示値はA260 = 1.62、A280 = 0.88、A230 = 0.77、希釈前の試料全量は50 µLです。
- 1. 10 mm換算 A260 = 1.62 (装置の表示値)
- 2. プラスミド濃度 = 1.62 × 50 ng/µL = 81.0 ng/µL
- 3. 総収量 = 81.0 ng/µL × 50 µL = 4,050 ng = 4.05 µg
- 4. A260/A280 = 1.62 / 0.88 = 1.84 (dsDNAの一般的な参考範囲内)
- 5. A260/A230 = 1.62 / 0.77 = 2.10 (一般的な参考範囲内)
A260 = 1.62が未換算の1 mm生データなら、濃度は810 ng/µL、総量は40.5 µgになります。核酸モードの10 mm換算済み表示値を再度10倍にしないでください。
よくある質問
A260から濃度への換算係数はどう使いますか？
10 mm換算光路長で、A260当たりの一般的な質量濃度係数はdsDNAが約50、RNAが40、ssDNAが33 ng/µLです。いずれも経験的な概算値で、塩基組成、構造、修飾に依存します。オリゴの正確な定量には配列固有の吸光係数を使ってください。
低いA260/A230から混入物を特定できますか？
できません。グアニジンやフェノールなどの残留試薬のほか、ブランク不一致や測定ノイズも比率を変化させます。A230がゼロに近い場合には非常に高い比率も生じます。実測スペクトル、ブランク、装置の測定範囲を確認してください。
pHやブランクはA260/A280に影響しますか？
pHやイオン強度は吸光度比に影響します。試料の緩衝液に合うブランクを使い、装置と抽出法の手順に従ってください。DNA約1.8、RNA約2.0は近似的な参考値で、pHによらない純度の証明ではありません。
3つの吸光度からスペクトルを再構成したりDNAとRNAを区別できますか？
できません。参考曲線はスペクトルの特徴を説明する模式例で、入力値から再構成したものではありません。3つの吸光度からピーク位置や全スペクトルは求められません。通常のA260定量にはDNA、RNA、他の紫外吸光物質も寄与します。必要に応じて実測波長スキャンや検証済みのDNA・RNA特異的測定法を使ってください。