プライマー溶解・希釈計算機
凍結乾燥プライマーを100 µM母液に溶解するための添加液量を計算し、10 µM PCR作業液の1:10希釈プロトコルを即座に作成します。
チューブ情報入力
チューブラベルの記載を確認 (例: 32.4 nmol)
添加する溶解液量
プライマー溶解計算機の使い方
- チューブまたは仕様書で実際の納品量（nmol）を確認します。注文時の合成スケールとは異なります。
- 原液濃度を選びます。100 µMは一般的な出発点ですが、すべての実験で必須ではありません。
- 溶媒量を確認し、適切なバッファーまたはヌクレアーゼフリー水を使用して、メーカーの再溶解手順に従います。
- 希釈タブで使用濃度の溶液を調製します。各プライマーを別々に計算し、反応中の最終濃度を確認します。
計算原理と公式
再溶解体積V（µL）は納品量n（nmol）と目標濃度C（µM）から求めます：
1 µM = 1 pmol/µL = 0.001 nmol/µL であるため、100 µM 溶液では 0.1 nmol/µL となり、必要容量は nmol × 10 となります。
計算例：乾燥プライマーからPCRへの添加まで
同じプライマーの再溶解、希釈、反応への添加を順に計算します。数値は計算例であり、実際の濃度は実験手順に従ってください。
1. 32.4 nmolから100 µM原液を調製
乾燥プライマーの量は32.4 nmolです。目標濃度で割り、nmolからpmolへの単位換算を行います。
V = 32.4 × 1000 / 100 = 324 µL
適切な溶媒324 µLを乾燥プライマーに加え、100 µM原液を調製します。
2. 10 µMの使用液を100 µL調製
例1の100 µM原液を使います。100 µLは混合後の総量であり、加える水の量ではありません。
V₁ = C₂V₂ / C₁ = 10 × 100 / 100 = 10 µL
原液10 µLと希釈液90 µLを混合します。原液1に対して希釈液9を加える10倍希釈です。
3. 20 µL反応へのプライマー添加量
例2の10 µM使用液から、1種類のプライマーの反応中最終濃度を0.5 µMにします。
V₁ = 0.5 × 20 / 10 = 1 µL
そのプライマーを1 µL添加します。フォワードとリバースの両方を同じ最終濃度にする場合は各1 µLを添加し、両方を20 µLの反応総量に含めます。
プライマー再溶解量の早見表
| 納品量（nmol） | 20 µM | 50 µM | 100 µM |
|---|---|---|---|
| 5 | 250 µL | 100 µL | 50 µL |
| 10 | 500 µL | 200 µL | 100 µL |
| 25 | 1250 µL | 500 µL | 250 µL |
| 50 | 2500 µL | 1000 µL | 500 µL |
| 100 | 5000 µL | 2000 µL | 1000 µL |
単位とよくある間違い
- nmolはプライマーの物質量、µMは単位体積あたりの濃度です。1 µM = 1 pmol/µLなので、100 µM = 100 pmol/µLです。
- 原液濃度、使用液濃度、反応中の最終濃度を区別してください。10 µM使用液を少量添加してもPCR全体が10 µMになるわけではありません。
- 希釈液量 = 最終体積 − 原液量です。原液に最終体積と同量の水を追加しないでください。
- 添加量がピペットの信頼できる範囲より小さい場合、中間希釈液を作るか調製総量を増やします。希釈で原液より高濃度にはできません。
TE バッファー (pH 8.0) — ストック保存に推奨
滅菌精製水 — 10 µM PCR作業液に推奨
配列計算の仮定と適用範囲
配列特性は5′から3′方向の未修飾一本鎖DNA（A、C、G、T）のみに対応します。空白と改行は無視しますが、RNA、曖昧な塩基、FASTAヘッダー、修飾表記は使用できません。分子量は水酸基末端の未修飾DNAを仮定します。修飾オリゴにはメーカーの分子量を使ってください。
Wallace Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)は塩基組成による概算です。塩、Mg²⁺、プライマー濃度、ミスマッチ、二次構造を考慮しないため、これだけでアニーリング温度を決めないでください。
よくある質問 (FAQ)
なぜ開封前に遠心する必要があるのですか？
開封前に閉じたチューブを短時間遠心して、キャップや壁面の試料を底に集めます。遠心と混合の条件はメーカーの指示に従ってください。
PCR 反応での標準的なプライマー終濃度は？
多くの PCR プロトコルでは 0.2 µM 〜 0.5 µM が終濃度として用いられます。10 µM に希釈しておくことで、20〜50 µL 系に 1 µL を加えるだけで簡便に調製できます。
溶解したプライマーの適切な保管方法は？
通常のDNAオリゴについて、IDTは適切なTEまたはヌクレアーゼフリー水に溶解した場合も含め、長期保存を−20°Cで行うことを推奨しています。修飾オリゴはメーカーの指示に従ってください。小分けは操作と汚染の機会を減らせます。
OD260 しか記載されていない場合はどう換算しますか？
可能ならメーカーの納品量（nmol）を使ってください。OD260からは配列固有の吸光係数、質量からは分子量を用いて換算します。短いオリゴへの一律のOD–質量係数は概算にすぎません。この計算機は吸光度ではなくnmolを入力します。
関連計算ツール
CodonTableの計算ツールで、希釈量やバッファーの調製量を確認できます。