プライマーTm値計算機｜PCRのTm・Ta
プライマー配列と反応条件を入力してTm値を計算し、PCRアニーリング温度の目安を確認します。
PCRプライマーTm値・アニーリング温度計算機
SantaLucia最近接塩基対モデルと塩・二価イオン補正を使用します。
1. 入力 プライマー 配列(s)
2. 反応・ポリメラーゼバッファー条件taq
このTaは一般的な開始目安で、ポリメラーゼ固有の設定値ではありません。メーカー指定のプライマーTm算出法と反応条件に従い、必要に応じて温度勾配で最適化してください。
Tm値の計算方法
1. 最近傍熱力学モデル (SantaLucia 1998)
PCRプライマー（通常18〜35塩基）に最も正確な手法です。隣接二塩基対のエンタルピー変化（ΔH°）とエントロピー変化（ΔS°）を積算して算出します：
R は気体定数（1.9872 cal/K·mol）、Ct は入力オリゴヌクレオチド濃度です。非自己相補配列では f = 4、自己相補配列では f = 1 とし、エントロピーに−1.4 cal/(K·mol)の対称性補正を加えます。塩補正は ΔS°salt = ΔS° + 0.368 · (N - 1) · ln([Na⁺]eq) です。
有効一価塩濃度は [Na⁺]eq (mM) = [Na⁺/K⁺] + 120 × √max(0, [Mg²⁺] − [dNTP]合計) と近似し、エントロピー補正にはMへ換算して用います。これは遊離Mg²⁺の推定を含む近似で、実際のTmはバッファー、添加剤、ポリメラーゼ系にも左右されます。
2. 塩濃度補正経験式 (Marmur-Doty)
14〜50塩基の標準的なオリゴヌクレオチドに広く用いられる経験式です：
3. Wallace則（14塩基未満の短鎖オリゴ用）
Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)Tm値・TaとPCR条件
最適なプライマー長 (18–24 nt)
18〜24塩基が最適です。ゲノム特異性を保ちつつ、高すぎるアニーリング温度を回避できます。
プライマー対の Tm 一致 (ΔTm ≤ 2°C)
フォワードとリバースの Tm 差を 1〜2℃ 以内に収めます。大きな差は非特異的増幅や低収量の主因となります。
3'末端 GC クランプ
3'末端の最後の5塩基中に1〜2個のGまたはCを配置するとポリメラーゼの結合が安定します。ただし3連続以上のG/Cは避けます。
よくある質問
Tm値の計算には何を入力しますか？
プライマー配列と画面に表示される反応条件を入力します。結果は入力した配列と条件に基づく計算値です。
Tm値とアニーリング温度（Ta）は同じですか？
Tm値は二本鎖の融解温度の計算値です。TaはPCR条件を検討する際の目安で、実際の設定は使用する試薬や反応条件に応じて確認してください。
塩濃度は計算結果に影響しますか？
はい。塩濃度はプライマー二本鎖の安定性に関わるため、計算結果は入力したイオン条件によって変わります。
この計算値だけでPCR条件を決められますか？
計算値は条件検討の参考です。使用するポリメラーゼ、バッファー、鋳型などに合わせて反応条件を確認してください。