NanoDrop 紫外分光光度定量

朗伯-比尔定律 (dsDNA, RNA, Oligos)

A260/A280 & A260/A230 纯度质控

核酸定量计算器 - NanoDrop 浓度与纯度 (A260/A280/A230)

根据 A260、吸光度对应光程和稀释倍数估算双链 DNA、RNA 或单链 DNA 浓度，计算 A260/A280、A260/A230 比值，并结合参考光谱示意理解可能的残留物影响。

核酸浓度与吸光度比值

根据 A260 估算浓度，比较 A260/A280 和 A260/A230 比值。

核酸类型

吸光度对应光程

稀释倍数（≥ 1）

原样品总体积（µL）

NanoDrop 核酸模式的读数通常已换算为 10 mm；即使仪器实际使用短光程，也应选 10 mm。只有明确未归一化的读数才选短光程。三个吸光度必须使用相同的光程基准。

A260

A280

A230

请使用扣除空白后的吸光度。A280 和 A230 可留空；计算比值要求 A260 及对应分母均大于零。

原样品浓度估算

42.5 ng/µL

0.043 µg/µL = 0.043 mg/mL

总量估算

2.13 µg

按原样品总体积计算，体积必须大于零。

A260 / A280

1.85

在比较范围内

典型值约 1.8；比较范围 1.7–2。

A260 / A230

2.07

在比较范围内

常见参考范围约 2.0–2.2。

浓度 = A260 ×（10 / 光程 mm）× 50 × 稀释倍数。总量（µg）= 浓度（ng/µL）× 原体积（µL）/ 1000。

比较范围仅供筛查。比值偏低或偏高可能与残留物、pH、空白不匹配或测量噪声有关；范围内的比值也不能证明纯度或完整性。尤其在低吸光度时，请结合仪器测量范围判断。

比尔-朗伯定律与消光系数

核酸浓度测定基于比尔-朗伯定律 (Beer-Lambert Law)：

A = ε · b · c ⟹ c = A / (ε · b)

其中 A 为 260 nm 处吸光度，b 为光程（cm），ε 为消光系数；c 的单位必须与 ε 一致。使用摩尔消光系数时，c 为 mol/L。以下经验系数用于估算质量浓度，对应 10 mm（1 cm）等效光程：

双链 DNA (dsDNA): 1.0 A₂₆₀ = 50 µg/mL (50 ng/µL)
单链 RNA (ssRNA): 1.0 A₂₆₀ = 40 µg/mL (40 ng/µL)
单链 DNA（一般估算）: 1.0 A₂₆₀ ≈ 33 µg/mL (33 ng/µL)

50 和 40 也是常用经验系数。短寡核苷酸、修饰核酸和特定序列的精确定量需使用其序列特异性消光系数。A260 会包含其他吸光物质的贡献，因此这里给出的是紫外法浓度估算。

纯度质控与异常排查：A260/A280 与 A260/A230

以下为近似参考值，不是污染物鉴定阈值。计算器将 dsDNA 的 A260/A280 与 1.7–2.0、RNA 与 1.9–2.2 比较；A260/A230 与 2.0–2.2 比较。比较范围用于提示进一步检查，不能证明样品纯净或完整。

样品	A260/A280	A260/A230	解读限制
dsDNA	≈ 1.8	≈ 2.0–2.2	比值受缓冲液、pH 和浓度影响
RNA	≈ 2.0	≈ 2.0–2.2	比值不能衡量 RNA 完整性
ssDNA / 寡核苷酸	依序列和测量条件而异		不自动作通用合格判断；定量宜使用序列特异性消光系数

紫外吸收光谱示意：DNA 与可能的残留物

教学示意，非实测数据。DNA 参考曲线以 A260 = 1 定标；另两条曲线在相同 DNA 背景上叠加吸收贡献。残留物也可能改变 A260，因此三条曲线没有分别归一化。

胍盐残留可使 230 nm 附近吸收升高，但这不是其专属特征。苯酚还可能改变 260–280 nm 区域。确定原因需要结合仪器实测扫描、空白和其他检测结果。

如何解释图和异常比值

上图用曲线说明 DNA 吸收与额外吸收物的可能影响，不随计算器输入变化。它不能代替样品的实测光谱；仅凭 A230、A260、A280 三个读数，也不能重建完整光谱或定位吸收峰。

A260/A280 偏低可能与蛋白质、酚、pH 或空白不匹配有关；A260/A230 偏低可能与提取试剂残留或空白不匹配有关。过高的比值也应复测，尤其当分母接近零时。首先核对空白液、测量范围和重复性，再按所用提取试剂盒的说明排查。

参考资料：Thermo Scientific NanoDrop Nucleic Acid Technical Guide · NanoDrop 2000 FAQ

核酸定量计算器实验案例：质粒小提抽提纯度分析

实战案例：质粒 DNA 小提 (Miniprep) 浓度与纯度质控

未稀释质粒洗脱液（稀释倍数 1）在 NanoDrop 核酸模式下的 10 mm 等效读数为 A260 = 1.62、A280 = 0.88、A230 = 0.77，原样品总体积为 50 µL。

1. 10 mm 等效 A₂₆₀ = 1.62 (仪器已换算)
2. 质粒浓度 = 1.62 × 50 ng/µL = 81.0 ng/µL
3. 总产量 = 81.0 ng/µL × 50 µL = 4,050 ng = 4.05 µg
4. A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.62 / 0.88 = 1.84 (在 dsDNA 常见参考范围内)
5. A₂₆₀/A₂₃₀ = 1.62 / 0.77 = 2.10 (在常见参考范围内)

若 A260 = 1.62 是未归一化的 1 mm 原始读数，浓度应为 810 ng/µL，总量为 40.5 µg。不要对 NanoDrop 核酸模式已换算的 10 mm 读数再作这次十倍换算。

常见问题解答 (FAQ)

A260 换算系数如何使用？

在 10 mm 等效光程下，dsDNA、RNA 和 ssDNA 的常用质量浓度系数分别约为每单位 A260 对应 50、40 和 33 ng/µL。这些是经验估算值；碱基组成、结构和化学修饰会影响吸光度。寡核苷酸的准确定量应使用序列特异性消光系数。

A260/A230 偏低能确定污染物吗？

不能。胍盐或酚等提取试剂残留可能影响比值，空白不匹配和测量噪声也可能造成异常。A230 接近零时可能出现很高的比值。应检查完整仪器光谱、空白和测量范围，不能凭一个比值指定污染物。

pH 和空白液如何影响 A260/A280？

pH 和离子强度会影响吸光度比值。空白液应与样品缓冲液匹配，并遵循仪器和提取方案的说明。DNA 约 1.8、RNA 约 2.0 只是近似参考值，不能当作不受 pH 影响的纯度证明。

三个吸光度能重建光谱或区分 DNA 与 RNA 吗？

不能。参考曲线用于说明光谱特征，不是由你的输入数据重建的。三个吸光度读数无法定位吸收峰或确定完整光谱。普通 A260 定量包含 DNA、RNA 和其他紫外吸光物质的共同贡献；需要时应查看实际波长扫描，并使用经过验证的 DNA 或 RNA 特异性检测方法。