蛋白质分子量计算器 (等电点 pI、消光系数与电荷滴定曲线)
输入氨基酸序列或 FASTA 格式，实时精确计算蛋白质平均分子量（Average MW）与单同位素质量（Monoisotopic Mass），自动推导理论等电点（pI）、280 nm 摩尔消光系数（ε280）、1 mg/mL 紫外吸光常数、分子化学式，并绘制交互式净电荷 vs pH 滴定曲线（辅助离子交换层析色谱 AEX/CEX 选型）与 Kyte-Doolittle 疏水性轮廓图。
氨基酸序列与蛋白预设
翻译后修饰 (PTM) 与重组纯化标签模拟
净电荷 vs. pH 滴定曲线 (Net Charge Titration 曲线)
在 pH 7.4 下，蛋白质携带净负电荷 (-19.96 e)。目标蛋白将牢固结合在带正电荷的阴离子交换树脂上（如 Q-Sepharose、DEAE、Capto Q）。带正电的杂蛋白将直接穿透流出。可用 NaCl 梯度（0 ~ 1.0 M）线性洗脱。
Kyte-Doolittle 氨基酸疏水性轮廓图 (Hydropathy Profile)
氨基酸组成与物理化学类别分布
下游实验联动工作流 (Next 步骤)
本计算器输出的分子量、消光系数与等电点，是后续蛋白定量、电泳比对和纯化透析的基准输入参数：
蛋白质分子量计算器生物物理原理与氨基酸理化参数
根据一级氨基酸序列预测蛋白质分子量是现代分子生物学与质谱分析的基础。当游离氨基酸通过核糖体翻译或人工固相合成连接成多肽链时，相邻氨基酸的 α-氨基（-NH₂）与 α-羧基（-COOH）发生脱水缩合反应形成肽键（-CO-NH-），每一条肽键的形成均会释放一分子水（H₂O，18.015 Da）。
平均分子量 (Average Molecular Weight)
采用自然界各化学元素同位素丰度的加权平均原子量（C: 12.011, H: 1.008, N: 14.007, O: 15.999, S: 32.065）。用于湿实验常规生化计算，例如 SDS-PAGE 胶条带位置、溶液摩尔浓度转换与冻干粉称量。
单同位素质量 (Monoisotopic Mass)
严格采用各元素丰度最高的最轻同位素原子量（¹²C: 12.00000, ¹H: 1.00783, ¹⁴N: 14.00307, ¹⁶O: 15.99491, ³²S: 31.97207）。是 Orbitrap、Q-TOF 等高分辨质谱（LC-MS/MS）鉴定完整蛋白或肽段碎片离子的绝对基准。
摩尔消光系数（ε280）则遵循生化权威 Pace et al. (1995) 经验模型：色氨酸（Trp）在 280 nm 贡献 5,500 M⁻¹cm⁻¹，酪氨酸（Tyr）贡献 1,490 M⁻¹cm⁻¹，二硫键（Cystine，由两个半胱氨酸氧化交联而成）贡献 125 M⁻¹cm⁻¹。在含 DTT、TCEP 或 β-巯基乙醇的还原性缓冲液中，二硫键被还原打开，消光系数需剔除胱氨酸贡献。
基于净电荷曲线的离子交换层析 (IEX) 条件优化与蛋白沉淀预防
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEX）是生物制药下游纯化工艺（Downstream Processing）中最关键的电荷分选手段。蛋白质分子的表面净电荷直接由溶剂 pH 决定：
阴离子交换 (AEX, pH > pI)
当缓冲液 pH 高于等电点时，蛋白质侧链去质子化，净电荷为负。蛋白质吸附于带正电的树脂（如 Q-Sepharose、DEAE），带正电杂质流出。
阳离子交换 (CEX, pH < pI)
当缓冲液 pH 低于等电点时，蛋白质侧链质子化，净电荷为正。蛋白质吸附于带负电的树脂（如 SP-Sepharose、CM），酸性核酸/内毒素流出。
等电沉淀风险区 (pH ≈ pI)
在等电点附近（±0.5 个 pH 单位），净电荷趋于零，分子间同种电荷斥力消失，疏水面极易堆叠形成不可逆沉淀。配液时切记避开此区间！
20 种标准天然氨基酸物理化学与质量参数对照表
多肽链的分子量、等电点、摩尔消光系数（ε280）及亲疏水性直接由一级序列中 20 种氨基酸残基的物理化学特性决定。脱水缩合后每一残基分子量等于完整游离氨基酸质量减去一分子水（-18.015 Da）。
| 代号 | 氨基酸名称 | 残基单同位素质量 | 残基平均分子量 | 侧链 pKa | pH 7.4 电荷 | 疏水性指数 | ε280 (M⁻¹cm⁻¹) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| R / Arg | 精氨酸 (Arginine) | 156.101 Da | 156.19 Da | 12.48 | +1.0 | -4.5 | — |
| K / Lys | 赖氨酸 (Lysine) | 128.095 Da | 128.17 Da | 10.53 | +1.0 | -3.9 | — |
| H / His | 组氨酸 (Histidine) | 137.059 Da | 137.14 Da | 6.00 | +0.09 | -3.2 | — |
| D / Asp | 天冬氨酸 (Aspartate) | 115.027 Da | 115.09 Da | 3.90 | -1.0 | -3.5 | — |
| E / Glu | 谷氨酸 (Glutamate) | 129.043 Da | 129.12 Da | 4.07 | -1.0 | -3.5 | — |
| W / Trp | 色氨酸 (Tryptophan) | 186.079 Da | 186.21 Da | — | 0.0 | -0.9 | 5,500 |
| Y / Tyr | 酪氨酸 (Tyrosine) | 163.063 Da | 163.18 Da | 10.07 | 0.0 | -1.3 | 1,490 |
| F / Phe | 苯丙氨酸 (Phenylalanine) | 147.068 Da | 147.18 Da | — | 0.0 | +2.8 | ~200 |
| C / Cys | 半胱氨酸 (Cysteine) | 103.009 Da | 103.14 Da | 8.33 | -0.1 | +2.5 | 125 |
| M / Met | 甲硫氨酸 (Methionine) | 131.040 Da | 131.20 Da | — | 0.0 | +1.9 | — |
| I / Ile | 异亮氨酸 (Isoleucine) | 113.084 Da | 113.16 Da | — | 0.0 | +4.5 | — |
| V / Val | 缬氨酸 (Valine) | 99.068 Da | 99.13 Da | — | 0.0 | +4.2 | — |
| L / Leu | 亮氨酸 (Leucine) | 113.084 Da | 113.16 Da | — | 0.0 | +3.8 | — |
| A / Ala | 丙氨酸 (Alanine) | 71.037 Da | 71.08 Da | — | 0.0 | +1.8 | — |
| P / Pro | 脯氨酸 (Proline) | 97.053 Da | 97.12 Da | — | 0.0 | -1.6 | — |
| N / Asn | 天冬酰胺 (Asparagine) | 114.043 Da | 114.10 Da | — | 0.0 | -3.5 | — |
| Q / Gln | 谷氨酰胺 (Glutamine) | 128.059 Da | 128.13 Da | — | 0.0 | -3.5 | — |
| S / Ser | 丝氨酸 (Serine) | 87.032 Da | 87.08 Da | — | 0.0 | -0.8 | — |
| T / Thr | 苏氨酸 (Threonine) | 101.048 Da | 101.11 Da | — | 0.0 | -0.7 | — |
| G / Gly | 甘氨酸 (Glycine) | 57.021 Da | 57.05 Da | — | 0.0 | -0.4 | — |
表中电荷为估算值；疏水性指数采用 Kyte–Doolittle 标度（正值偏疏水，负值偏亲水）。消光系数按 280 nm 下 Trp、Tyr 和二硫键的贡献列示。
💡 计算说明：完整多肽分子量 = ∑(残基质量) + 18.015 Da (末端 H 与 OH 加成)。若包含 N-端乙酰化、C-端酰胺化或磷酸化修饰，需分别校正相应化学基团增量。
蛋白质分子量计算器实操示例：牛血清白蛋白 (BSA) 理化特性全解析
牛血清白蛋白（BSA）常用作生化实验的参考蛋白。以下为成熟型序列的示例计算值：
这些数值是基于序列和模型的估算；蛋白质来源、异构体、修饰及缓冲液条件都会影响实测结果。离子交换介质和溶解度应根据实际样品与实验条件验证。
常见问题解答 (FAQ)
Q1蛋白质分子量是如何根据氨基酸序列计算得出的？
计算器累加序列中 20 种天然氨基酸残基的分子量，并加上 18.015 Da（一分子水 H2O）以补全游离的 N 端 -H 和 C 端 -OH。每形成一个肽键都会脱去一分子水（N 个残基有 N-1 个肽键）。
Q2单同位素质量（Monoisotopic Mass）与平均分子量（Average MW）有何区别？
单同位素质量采用自然界丰度最高的最轻同位素（12C, 1H, 14N, 16O, 32S）原子量计算，是高分辨质谱（LC-MS/MS）定性与鉴定的金标准；平均分子量采用各元素的丰度加权原子量，常用于 SDS-PAGE 跑胶比对、试剂溶液配制等常规湿实验。
Q3净电荷 vs. pH 曲线如何指导离子交换层析（IEX）柱的选择？
当工作缓冲液 pH > pI 时，蛋白质带净负电荷，推荐结合强阴离子交换层析（AEX，如 Q-Sepharose、Capto Q）；当 pH < pI 时，蛋白质带净正电荷，推荐结合强阳离子交换层析（CEX，如 SP-Sepharose、Capto S）。当 pH 处于 pI 附近（±0.5）时，静电排斥力趋近于零，极易诱发疏水聚集沉淀，纯化或储存缓冲液应至少距离 pI 1 个 pH 单位以上。
Q4摩尔消光系数 (ε280) 与 A280 吸光度是如何计算的？
采用 Pace (1995) 经验公式：ε280 = (nTrp × 5500) + (nTyr × 1490) + (nCystine × 125) M⁻¹cm⁻¹，其中 nCystine 为二硫键对数（向下取整 nCys / 2）。在还原剂（DTT、TCEP）存在下，二硫键被打开，Cystine 贡献计为 0。1 mg/mL 样品的理论 A280 吸光度常数等于 ε280 除以平均分子量。
Q5为什么目标蛋白在 SDS-PAGE 电泳中的表观分子量与理论计算分子量不一致？
常见原因包括：1) 翻译后修饰（尤其是糖基化修饰，N/O-糖链可使表观条带明显滞后数 kDa 至数十 kDa）；2) 异常的 SDS 结合比例（富含脯氨酸或强酸性残基的蛋白结合 SDS 较少，荷质比下降导致跑胶偏大）；3) 强疏水跨膜蛋白在凝胶中迁移异常；4) 未加还原剂（DTT/β-ME）导致分子内二硫键未完全打开，蛋白保持紧凑构象跑胶偏小。
Q6分泌信号肽截短与重组纯化标签如何影响最终蛋白质分子量？
真核或大肠杆菌分泌表达的重组蛋白，其 N 端前导信号肽（通常 15–30 个残基，约 1.5–3.5 kDa）会在转运出膜过程中被信号肽酶切除。相反，人工添加的纯化标签会增加分子量：His6 标签增加约 0.84 kDa，FLAG 标签增加约 1.01 kDa，HA 增加约 1.10 kDa，GST 增加约 26.0 kDa。可在上方“修饰与标签”面板中一键勾选模拟。
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