哺乳动物细胞生物学

Lipofectamine 2000 / 3000 & PEI 实验方案

多孔板等比缩放与 Master Mix 配制

转染计算器 (Lipofectamine 2000/3000 与 PEI 质粒转染体系)

根据实验孔数与器皿规格（从 96 孔板到 T-75 培养瓶），精确计算质粒 DNA 质量、转染试剂用量（Lipofectamine 2000/3000、PEI、FuGENE）、Opti-MEM 稀释体积及双管预混操作配方。

转染条件

计算两管法复合物配制所需的质粒 DNA 量和脂质/聚合物转染试剂体积。

培养器皿规格

转染试剂

孔数 / 重复数

每孔 DNA 用量（µg）

DNA 储液 Conc (ng/µL)

Reagent : DNA Ratio (µL : µg)每 1 µg DNA 需要加入 2 µL P3000 试剂。

移液余量（%）补偿容器壁吸附和移液损耗

双管转染混合液

3 个孔（额外量 10%，总制备倍率 3.30×）

管 A: Diluted Plasmid DNA

Opti-MEM（低血清培养基）：412.5 µL

Plasmid DNA (8.25 µg):8.3 µL

P3000 Reagent (2 µL/µg):16.5 µL

管 B: Diluted Transfection Reagent

Opti-MEM（低血清培养基）：412.5 µL

Lipofectamine 3000:16.5 µL

Execution Protocol:

将 A 管加入 B 管，轻轻吹打混匀 3–5 次。
Incubate at room 温度 for 10–15 min.
Dispense 262.5 µL complex per 孔 dropwise.
轻轻晃动培养板，放回 37°C 培养箱；按实验方案在 24–48 小时后收集样品。

转染计算器生物物理原理：质粒复合与电荷比优化

哺乳动物细胞瞬时转染依赖于带正电荷的转染试剂与带负电荷的 DNA 磷酸二酯骨架结合，自组装形成纳米级阳离子复合物（脂质复合物 Lipoplex 或聚合物复合物 Polyplex）。复合物通过静电吸附与细胞膜表面的唾液酸和硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合，经胞吞作用进入细胞。

阳离子脂质体 (Lipofectamine)

带正电的亲水头部和疏水脂质尾部自组装形成双分子层包裹 DNA，与内体膜融合促使质粒释放至细胞质中。

阳离子聚合物 (PEI)

聚乙烯亚胺将质粒 DNA 压缩为致密复合体，并在内体中通过“质子海绵效应”引起渗透性吸水膨胀和破裂，释放完整质粒。

提升哺乳动物细胞转染效率的核心质控参数

最佳细胞融合度 (70–90%)

不少实验会提前铺板，并以加入复合物时约70–90%融合度作为优化起点。合适的密度和细胞状态因细胞与试剂而异，请按产品指南及本实验条件优化。

复合物制备条件

复合物制备所用培养基和是否添加抗生素应按转染试剂的操作说明确定。不同试剂和细胞体系的条件可能不同。

质粒内毒素严控

对内毒素敏感的细胞或实验应考虑使用低内毒素质粒制备流程。A260/A280反映核酸样品的部分纯度信息，不能用于测量内毒素。

双管法配制流程图

脂质体转染标准化双管配液流程 (DNA稀释管 + 试剂稀释管)

标准操作流程（SOP）

操作提示：许多转染试剂流程会先分别稀释 DNA 和试剂，再按产品说明混合。稀释液、混合比例和孵育时间因试剂与细胞而异；请遵循对应产品的操作指南。

转染计算器实战示例：6孔板 Lipofectamine 3000 实验配方

实战案例：Lipofectamine 3000 进行 6 孔板 3 复孔转染配制

使用 6 孔板转染 HEK293T 细胞 3 个孔，每孔质粒 DNA 2.5 µg（DNA 储备液浓度 1000 ng/µL，设置 10% 移液损耗余量，总体积扩大为 3.3×）。

1. 所需质粒 DNA 总量：2.5 µg × 3.3 = 8.25 µg DNA (8.25 µL plasmid stock)
2. Tube A: 412.5 µL Opti-MEM + 8.25 µL DNA + 16.5 µL P3000 reagent (2 µL/µg)
3. Tube B: 412.5 µL Opti-MEM + 16.5 µL Lipofectamine 3000 (ratio 2:1 = 5.0 µL/well × 3.3)
4. 混合 Tube A 与 Tube B，室温静置孵育 15 分钟。
5. 每孔逐滴加入 250 µL 复合物（孔内已有 2.0 mL 完全培养基）。

常见问题解答 (FAQ)

为什么转染复合物必须在无血清培养基（如 Opti-MEM）中配制？

血清中的白蛋白等大分子带负电荷，会竞争性结合阳离子脂质体或聚合物，阻碍紧密纳米复合物的形成，从而大幅削弱基因递送效率。

Lipofectamine 3000 中的 P3000 试剂起到什么作用？

P3000 是一种纳米缩合试剂，在脂质体包被前将质粒 DNA 预先紧密压缩为超微颗粒，显著增强其逃逸内吞小泡并穿透核孔复合体的能力。

为什么在转染过程中通常建议避免使用双抗（青霉素-链霉素）？

阳离子转染试剂会短暂增加细胞膜的通透性。在此状态下，细胞外的链霉素等抗生素会异常大量渗入细胞内部，引发严重的细胞毒性与凋亡。

脂质转染时最适的细胞汇合度（Confluency）是多少？

大多数贴壁细胞的最佳转染汇合度为 70% 至 90%。细胞必须处于旺盛的对数生长期，有丝分裂期间核膜破裂最有利于外源质粒进入细胞核转录。